CNSH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH - Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn

TỔNG QUAN
Vô sinh là một vấn đề sức khỏe cộng đồng toàn cầu, ảnh hưởng đến khoảng 15% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản. Mặc dù các công nghệ hỗ trợ sinh sản (Assisted reproduction technologies - ART) như thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF), bơm tinh trùng vào buồng tử cung (Intrauterine insemination - IUI) và tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intracytoplasmic sperm injection - ICSI) đã có nhiều tiến bộ, tỷ lệ sinh con sống sau ART vẫn chỉ khoảng 30%.
Chất lượng tinh trùng là yếu tố then chốt quyết định sự thành công của quá trình thụ tinh trong ART. Trong cơ thể phụ nữ, chỉ những tinh trùng có khả năng thụ tinh mới vượt qua các hàng rào chọn lọc tự nhiên để đến được noãn. Tuy nhiên, trong ART, việc lựa chọn tinh trùng ban đầu thường chỉ dựa vào khả năng di động và mật độ. Những tiêu chí này chưa đủ để phân biệt và chọn lọc tinh trùng chất lượng cao dựa trên tiềm năng thụ tinh và chất lượng di truyền.
Để giải quyết vấn đề này, nhiều phương pháp chọn lọc tinh trùng tiên tiến đã được phát triển. Các phương pháp này tập trung vào đặc tính nội tại của tinh trùng hoặc mô phỏng cơ chế chọn lọc tự nhiên trong đường sinh sản của phụ nữ. Mặc dù có những nỗ lực này, kết quả lâm sàng của các phương pháp mới vẫn còn trái ngược và nhiều kỹ thuật chỉ có thể xử lý lượng mẫu nhỏ. Điều này nhấn mạnh nhu cầu cấp thiết về các cách tiếp cận mới để chọn lọc tinh trùng trong ART.
Trong ống dẫn trứng, tinh trùng có khả năng thụ tinh sẽ liên kết với zona pellucida (ZP) – lớp màng bao quanh noãn – sau đó trải qua phản ứng acrosome để xâm nhập và dung hợp với noãn. Sự khiếm khuyết trong tương tác tinh trùng-ZP là một trong những nguyên nhân chính gây vô sinh nam và thất bại thụ tinh trong IVF.
Tương tác tinh trùng-ZP xảy ra khi các thụ thể protein trên tinh trùng nhận diện các phối tử đặc hiệu trên ZP. Đáng chú ý, trong hàng triệu tinh trùng của nam giới có khả năng sinh sản, chỉ khoảng 14% tinh trùng di động có khả năng liên kết với ZP, và trong số đó, chỉ 48% có thể trải qua phản ứng acrosome do ZP gây ra. Những quan sát này gợi ý rằng ZP của con người có vai trò chọn lọc tinh trùng chất lượng cao với tính toàn vẹn di truyền và khả năng thụ tinh vượt trội.
Tuy nhiên, bằng chứng trực tiếp xác nhận vai trò chọn lọc của ZP ở người vẫn còn thiếu. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là khẳng định vai trò chức năng của ZP ở người trong việc lựa chọn tinh trùng có khả năng thụ tinh.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thu thập tinh dịch và noãn

• Tinh dịch: Mẫu tinh dịch được thu thập từ nam giới đến kiểm tra tiền hôn nhân, có sự đồng thuận của BN. Chỉ những mẫu tinh dịch bình thường theo tiêu chí WHO (phiên bản thứ năm) được sử dụng.

• Noãn: Noãn chưa trưởng thành (GV/MI) hoặc noãn MII trưởng thành không thụ tinh được hiến tặng từ phụ nữ vô sinh tham gia điều trị IVF. Noãn có hình thái bất thường được loại bỏ.

Đánh giá khả năng sống và di chuyển của tinh trùng
Khả năng di chuyển của tinh trùng được phân tích bằng hệ thống phân tích tinh trùng hỗ trợ bởi máy tính (computer-assisted sperm analysis - CASA). Khả năng sống của tinh trùng được xác định bằng xét nghiệm loại trừ xanh trypan. Tối thiểu 200 tinh trùng/mẫu được định lượng.
Thu nhận tinh trùng gắn ZP
Tinh trùng gắn ZP được thu thập bằng xét nghiệm đồng ủ tinh trùng-ZP. 4 noãn người được ủ với 2 triệu tinh trùng trong 30 phút. Tinh trùng gắn chặt với ZP sau đó được tách ra bằng cách hút mạnh bằng pipet thủy tinh để phân tích tiếp.
Thu nhận tinh trùng không gắn ZP
Tinh trùng không gắn ZP được thu thập từ xét nghiệm đồng ủ tinh trùng-ZP kéo dài. 4 noãn người được ủ với 1 triệu tinh trùng trong 6 giờ, chỉ những tinh trùng gắn chặt với ZP bằng đầu mới được định lượng. Sau khi tách tinh trùng ZP, tất cả tinh trùng còn lại trong giọt ủ sau 6 giờ được coi là tinh trùng không gắn ZP và được thu thập để phân tích.
Đánh giá tình trạng acrosome và hình dạng của tinh trùng
Trạng thái acrosome của tinh trùng được đánh giá bằng phương pháp nhuộm FITC-PSA. Tinh trùng được nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Hình dạng tinh trùng được đánh giá thủ công dưới kính hiển vi quang học sau khi nhuộm. Tối thiểu 100 tinh trùng/mẫu được định lượng theo tiêu chuẩn nghiêm ngặt của WHO để xác định tỷ lệ hình dạng bình thường.
Đánh giá tốc độ phân mảnh DNA, tổn thương DNA và tính toàn vẹn của Chromatin
Tốc độ phân mảnh DNA của tinh trùng được xác định bằng xét nghiệm TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). Tinh trùng được cố định, thấm và ủ với hỗn hợp phản ứng chứa TdT và fluorescein-dUTP.
Mức độ tổn thương DNA được đánh giá bằng phương pháp nhúng tinh trùng trong agarose, ly giải, điện di trong môi trường kiềm và nhuộm SYBR Green I. Mức độ tổn thương DNA được xác định bằng cách đo phần trăm DNA đuôi và mômen đuôi bằng phần mềm chuyên dụng.
Tính toàn vẹn của chromatin tinh trùng được đánh giá bằng nhuộm acridine orange (AO). Tinh trùng được cố định và nhuộm với AO. Tinh trùng có chromatin bình thường (DNA sợi đôi) phát huỳnh quang xanh lục sáng, trong khi tinh trùng có chromatin bất thường (DNA sợi đơn) phát huỳnh quang cam/vàng.
Đánh giá mức độ thiếu hụt Protamine và Methyl hoá
Mức độ thiếu hụt protamine được đánh giá bằng nhuộm chromomycin A3 (CMA3). Tinh trùng được cố định và ủ với CMA3. Cường độ huỳnh quang màu vàng (CMA3 dương tính) cho biết mức độ thiếu hụt protamine.
Mức độ methyl hóa trong tinh trùng được xác định bằng nhuộm miễn dịch với kháng thể anti-5-methylcytosine (5-mC). Tinh trùng được cố định, biến tính, và ủ với kháng thể chính 5-mC, sau đó là kháng thể thứ cấp gắn huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang xanh lục (5-mC dương tính) cho biết mức độ methyl hóa.
Phân tích Dữ liệu
Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism 9.1.0. Kiểm định t hoặc kiểm định Mann-Whitney  được sử dụng để so sánh các phân nhóm tinh trùng gắn ZP và không gắn ZP. Giá trị P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
KẾT QUẢ
Nghiên cứu này đã phân tích đặc điểm và chất lượng của tinh trùng liên kết với ZP,  làm nổi bật vai trò chọn lọc của ZP trong quá trình thụ tinh.
Thu hồi tinh trùng gắn ZP và ảnh hưởng của thời gian ủ
Trung bình 150 tinh trùng gắn ZP được thu hồi trong 2 giờ đầu đồng ủ, với tổng số lượng giảm dần và ổn định sau 20 giờ. Quá trình ủ kéo dài tới 6 giờ không ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng sống, khả năng di chuyển hay tính toàn vẹn DNA của tinh trùng.
Phản ứng Acrosome và biểu hiện protein
Tỷ lệ phản ứng acrosome của tinh trùng gắn ZP tương đương với nhóm đối chứng ở 15 và 30 phút, nhưng cao hơn đáng kể ở 60 và 120 phút so với tinh trùng không gắn ZP (63,7% ± 10,1 và 70,9% ± 4,4 so với 26,3% ± 11,7; p<0,05). Các protein HSPA2 và SPACA3 đều hiện diện và định vị ở vùng đầu tinh trùng đã được hoạt hóa. Đáng chú ý, 86% tinh trùng gắn ZP thu được sau 30 phút đều dương tính với HSPA2 hoặc SPACA3. Tỷ lệ và cường độ tín hiệu của cả HSPA2 và SPACA3 đều cao hơn đáng kể ở tinh trùng gắn ZP so với tinh trùng không gắn ZP (p<0,05).
Hình dạng và chất lượng di truyền
Số lượng tinh trùng có hình dạng thường cao hơn đáng kể ở nhóm gắn ZP so với nhóm không gắn ZP. Về chất lượng di truyền, tinh trùng gắn ZP cho thấy sự vượt trội rõ rệt:

• Phân mảnh DNA: Có mức DNA đuôi và mômen đuôi thấp hơn đáng kể trong xét nghiệm Comet (p<0,05), và tỷ lệ tinh trùng dương tính với TUNEL (DNA bị phân mảnh) thấp hơn đáng kể (p<0,05).

• Tính toàn vẹn Chromatin: Tỷ lệ tinh trùng có DNA sợi đôi bình thường cao hơn đáng kể ở tinh trùng gắn ZP (p<0,05).

Nhiễm Protamine và Methyl hóa
Mức độ thiếu hụt protamine (CMA3 dương tính) ở tinh trùng gắn ZP thấp hơn đáng kể (p<0,05), cho thấy ZP chọn lọc tinh trùng có mức độ protamine cao hơn. Ngoài ra, mức độ methyl hóa tổng thể cao hơn ở tinh trùng gắn ZP so với tinh trùng không gắn ZP.
Tóm lại, những kết quả này cung cấp bằng chứng thuyết phục rằng ZP có khả năng chọn lọc những tinh trùng có chất lượng di truyền, hình dạng, và biểu sinh vượt trội, làm nổi bật vai trò quan trọng của tương tác tinh trùng-ZP trong quá trình thụ tinh.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu này đã chứng minh rằng khả năng liên kết ZP của tinh trùng có mối tương quan chặt chẽ với chất lượng di truyền, bao gồm tính toàn vẹn của DNA, cấu trúc chromatin, mức độ protamine hóa và mức độ methyl hóa. Điều này cho thấy ZP của người có tính chọn lọc cao đối với những tinh trùng có chất lượng di truyền bình thường và các đặc điểm biểu sinh riêng biệt.
Để ZP trở thành một công cụ lâm sàng hữu ích, cần xây dựng cơ sở dữ liệu lớn từ các mẫu lâm sàng đa dạng về khả năng liên kết ZP. Việc này sẽ giúp chuẩn hóa việc xác định tinh trùng chất lượng cao thông qua phân tích hình ảnh hình thái.

Tài liệu tham khảo: Leung, E. T., Lee, B. K., Lee, C. L., Tian, X., Lam, K. K., Li, R. H., ... & Chiu, P. C. (2023). The role of spermatozoa-zona pellucida interaction in selecting fertilization-competent spermatozoa in humans. Frontiers in Endocrinology, 14, 1135973.